哺乳动物早期发育是一个复杂有序的过程。小鼠受精卵从原核形成，2细胞期合子基因组激活，随后不对称卵裂形成极性，到囊胚形成完成第一次的分化[1]。伴随着胚胎的增殖分化，基因调控网络动态变化、表观遗传修饰擦除并重新建立，代谢水平从简单静息变得活跃复杂[2,3]。越来越多的研究发现代谢在胚胎发育过程中发挥着重要的调控作用[4,5]，但由于胚胎样本有限且缺乏高灵敏度代谢组学技术，人们对代谢调控研究更多集中在体外培养的多能干细胞（Pluripotent stem cells, PSCs），至今仍然缺乏系统性的代谢调控早期胚胎发育的研究报道[6]。
近日，浙江大学医学院干细胞与再生医学中心张进课题组与清华大学药学院胡泽平课题组合作在Nature Metabolism 上发表题为“Metabolic remodeling during early mouse embryo development ”的研究论文, 该研究通过对小鼠早期胚胎发育进行代谢组学与转录组学的研究，首次系统地绘制了小鼠早期胚胎发育中的代谢重塑和代谢调节的过程。研究团队首先优化了超高效液相色谱串联质谱靶向检测代谢组的方法（图1），分别测定262个代谢物在2细胞期胚胎和囊胚中的含量，主成分分析发现两个时期的代谢特征差异显著，代谢物差异分析和富集分析都表明2细胞胚胎中富集甲硫氨酸、精胺/亚精胺和烟酰胺等代谢通路的代谢物，而囊胚中富集三羧酸循环（TCA）和嘌呤代谢通路的代谢物（图2）。图1：代谢组研究流程
此前，研究团队与MIT的James Collins教授和波士顿儿童医院的George Daley教授开发了代谢网络模型（Cell Report , 2018)，将两个时期的代谢物检测结果比对到该代谢网络模型中，同样也表明2细胞期胚胎更倾向谷胱甘肽这样的还原态代谢，而囊胚期更倾向氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OxPhos）这样的氧化态代谢。图2:差异代谢物富集分析
为了增加代谢组学结果的可靠性，研究团队采用相同的方法研究了体外二细胞样细胞（2C-like cell, 2CLC）与胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell, ESC）的代谢特征。通常认为2细胞期胚胎具有发育成完整个体的全能性，而囊胚期内细胞团具有分化成三个胚层的多能性，体外研究中一般将2CLC作为2细胞期胚胎的模型，而取自内细胞团细胞建系的ESC一般作为囊胚期胚胎的模型。可能因为体外培养的影响，2CLC和2细胞期胚胎代谢特征不同，ESC与囊胚的代谢特征也不相同，相对胚胎而言，2CLC与ESC的代谢特征相对接近。即使如此，2细胞期胚胎和2CLC交集部分，表明谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量以及多胺类化合物等与氧化还原相关的代谢物含量都高，表明这两种细胞可能都处于更还原的状态。而囊胚和ESC中TCA通路的代谢物较多，表明这两种细胞处于更加氧化的状态（图2）。
近些年，随着单细胞测序技术和微量表观遗传学检测技术的应用，使我们对胚胎早期发育过程中的转录水平调控，DNA甲基化，组蛋白修饰，染色体开放程度的动态变化有了深入的了解，同时公共数据库中也储存了大量的高通量测序数据。研究团队对公共数据库中的小鼠早期胚胎不同发育阶段的细胞群RNA-seq和单细胞RNA-seq进行了数据挖掘，其中变化最剧烈且结果一致的两个基因类别是能量代谢和蛋白翻译。对其中与代谢相关的3000个基因表达水平分析，无论是一群细胞的RNA-seq结果还是单细胞RNA-seq结果，都表明囊胚期胚胎参与TCA循环和OxPhos这两个代谢过程的基因高表达，而MII卵和2细胞期胚胎差异表达基因主要富集在磷酸肌醇信号通路相关基因，提示脂质代谢和卵子成熟和胚胎早期发育相关（图3）。图3：不同发育阶段代谢相关3000基因的表达变化(左)和富集分析（右）
胚胎的发育过程受到发育相关转录因子的精密调控，研究团队针对代谢相关基因启动子区域进行了转录因子结合序列的富集分析，发现Esrrb, Klf, Myc 和 Nr5a2等转录因子是8细胞期或者囊胚期的代谢相关基因的上游调控因子。利用已发表的RNA-seq和ChIP-seq数据，研究组建立了胚胎发育各个时期转录因子-代谢相关基因的调控网络，调控网络从2细胞期到囊胚期变得越来越复杂，而在囊胚期我们也能看到与TCA循环和OxPhos相关的基因，如Ndufs2, Ndufc1, Ndufa1, Sdhc, Atp4a等很多都是内细胞团相关转录因子的靶基因（图4）。这与前面的转录组学和代谢组学的结果一致，也说明了胚胎的代谢活动受到经典的发育相关转录因子的调控。随后，研究组又用胚胎干细胞中的ChIP-seq去验证这一结果，发现Esrrb, Myc 和 Klf参与TCA循环和OxPhos的调控，Sox2, Stat3 和Nanog较少或不参与TCA循环和OxPhos的调控（图4）。图4：不同发育阶段发育相关转录因子（左）ChIP-seq的验证结果（右）
前期的研究发现，代谢活动从2细胞时期胚胎从还原性代谢的转变成囊胚期氧化性代谢，与此一致的是TCA循环的代谢物α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid，α-KG）在囊胚中比二细胞期胚胎更高；有趣的是，α-酮戊二酸的竞争性代谢物2-羟基戊二酸（L-2-Hydroxyglutarate, L-2-HG）属于最明显的二细胞含量更高的差异代谢物之一（图5）。已有研究发现这一对代谢物可以互相转变，在其他组织和疾病中发挥表观调控和细胞命运决定作用[7]。为了更加直接的了解代谢物如何调控基因的转录表达和胚胎的发育，研究组针对代谢物α-KG和L-2-HG进行了深入研究。图5：2-HG和α-KG的含量
2-HG主要有两种镜像异构体，L型与D型。D-2-HG作为“oncometabolite”已经在肿瘤细胞中有了相对深入的研究。研究团队首先鉴定了胚胎中检测到的是通常生理条件下存在的L-2-HG。接着研究团队发现卵母细胞中L-2-HG含量最高，绝对定量显示可以达到mM级别的浓度，这与具有IDH1/2突变的癌症细胞中的D-2-HG的浓度类似。图6 互为镜像异构体的D-2-HG与L-2-HG分别在肿瘤和早期胚胎发育两种截然不同的病理和生理条件下发挥作用。D-2-HG存在于具有IDH1/2突变的肿瘤细胞，而L-2-HG则存在于卵母细胞/早期胚胎。
随着受精后胚胎的发育，L-2-HG含量逐渐降低。早期胚胎体外培养过程中添加外源性L-2-HG会阻碍胚胎的发育。2-HG作为去甲基化酶的辅助因子α-KG的竞争性拮抗剂，可能参与受精后一系列组蛋白的去甲基化过程。研究团队发现如果阻止发育过程中L-2-HG水平的降低，将造成H3K4me3等组蛋白修饰擦除的阻滞（图7）。图7：L-2-HG在早期胚胎发育过程中通过影响H3K4me3甲基化的擦除
此外，该论文还报道了一种可以清除L-2-HG的L-2-羟基戊二酸脱氢酶（L2hgdh）在二细胞胚胎后期表达量急剧上升。通过siRNA敲低L2hgdh的表达，可以造成L-2-HG水平上升，以及H3K4me3擦除的阻滞。
最后总结，研究团队通过高灵敏靶向代谢组的研究方法，整合转录组学分析了小鼠2细胞胚胎和囊胚的代谢特征，发现2细胞时期胚胎代谢活动水平低下，处于一种还原态，而囊胚时期代谢水平更加活跃，处于一种氧化态，进一步的研究也发现囊胚期的代谢活化与Klf、Myc、Esrrb等胚胎发育相关转录因子激活相关。伴随着两种代谢状态的改变，一对可以相互转变却相互竞争的代谢物L-2-羟基戊二酸（L-2-Hydroxyglutarate, L-2-HG）和α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid，α-KG）的量也发生此消彼长的变化，研究组最终证明L-2-HG在早期胚胎发育过程中通过影响H3K4me3甲基化的擦除影响胚胎的发育的分子机制。
浙江大学的博士生赵静，清华大学的博士生姚珂，浙江大学的博士后余华、博士后张玲、博士生徐雨雁是文章的共同第一作者。浙江大学的张进研究员和清华大学的胡泽平研究员是文章的共同通讯作者。研究得到了梅奥诊所Hu Li、清华大学颉伟、浙江大学傅旭东、范衡宇、张丹、徐鹏飞、叶存奇、华东师范大学赵玉政、复旦大学叶丹等国内外课题组的支持。该项研究还得到了科技部“干细胞研究与转化”“发育编程及其代谢调节”重点专项、国家自然科学基金糖脂代谢的时空调控专项/浙江省自然科学基金、浙江大学医学中心/良渚实验室和浙江大学医学院附属第一医院的支持。
参考文献：
1. Chen L, Wang D, Wu Z, Ma L, Daley GQ (2010) Molecular basis of the first cell fate determination in mouse embryogenesis. Cell research 20 (9):982-993. doi:10.1038/cr.2010.106
2. Leese HJ (2012) Metabolism of the preimplantation embryo: 40 years on. Reproduction (Cambridge, England) 143 (4):417-427. doi:10.1530/rep-11-0484
3. Xu Q, Xie W (2018) Epigenome in Early Mammalian Development: Inheritance, Reprogramming and Establishment. Trends in cell biology 28 (3):237-253. doi:10.1016/j.tcb.2017.10.008
4. Nagaraj R, Sharpley MS, Chi F, Braas D, Zhou Y, Kim R, Clark AT, Banerjee U (2017) Nuclear Localization of Mitochondrial TCA Cycle Enzymes as a Critical Step in Mammalian Zygotic Genome Activation. Cell 168 (1-2):210-223.e211. doi:10.1016/j.cell.2016.12.026
5. Chi F, Sharpley MS, Nagaraj R, Roy SS, Banerjee U (2020) Glycolysis-Independent Glucose Metabolism Distinguishes TE from ICM Fate during Mammalian Embryogenesis. Developmental cell 53 (1):9-26.e24. doi:10.1016/j.devcel.2020.02.015
6. Zhang J, Zhao J, Dahan P, Lu V, Zhang C, Li H, Teitell MA (2018) Metabolism in Pluripotent Stem Cells and Early Mammalian Development. Cell metabolism 27 (2):332-338. doi:10.1016/j.cmet.2018.01.008
7. Ye D, Guan KL, Xiong Y (2018) Metabolism, Activity, and Targeting of D- and L-2-Hydroxyglutarates. Trends in cancer 4 (2):151-165. doi:10.1016/j.trecan.2017.12.005
本文转载自公众号“iNature”（Plant_ihuman）
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原标题：《【科技前沿】张进/胡泽平课题组合作揭示小鼠着床前胚胎发育的代谢重塑与代谢调控》
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